降落PCR

尽管目前PCR技术已相当普遍和成熟，但由于PCR反应中许多条件（如Mg2+、dNTPs、引物、模板、循环中的参数等）仍然会影响实验结果，特别对于一些复杂的基因组DNA模板，普通PCR往往存在非特异性扩增，得不到理想的产物。为了解决PCR非特异性扩增的问题，Don等人于1991年发明了降落PCR（touchdown PCR，TD-PCR）技术。

技术原理

降落PCR是通过对反应体系中退火温度进行优化来提高反应的特异性，其基本原理为：根据引物的Tm值，设置一系列从高到低的退火温度，开始选择的退火温度高于估计的Tm值，每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃）退火温度，随着循环的进行，退火温度逐渐降低至Tm值，最终低于Tm值达到一个较低的退火温度。最后以此退火温度进行10个左右的循环。

PCR反应中退火温度会对扩增结果产生影响，随着退火温度的升高，扩增特异性会变好，同时扩增效率会变低。退火温度过高会使PCR效率过低，退火温度过低则会使非特异性扩增过多。降落PCR一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性（在较高的退火温度下通常得到特异性扩增产物），待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级数的起始优势，在剩余反应中非特异的位点由于丰度低无法和特异位点竞争，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。

降落PCR具有以下三个特点：

• 低水平、高特异性的扩增在循环的早期开始，此时的退火温度高于“最合适”的退火温度；
• 当退火温度在目的产物的Tm值与假阳性产物的Tm值之间时，目的产物的竞争优势更加明显；
• 较低的退火温度能很有效地增加目的产物的产量，同时使非特异性的扩增降到最低，因为特异序列在较高退火温度时得到扩增，等退火温度降到较低时，已积累大量的特异产物，减少了特异引物与非特异序列结合的机会。

退火温度设置

通常降落PCR的退火温度范围可跨越15℃，从高于Tm值几度到低于其10℃左右，在每个温度上循环1~2个周期，然后在较低的退火温度上循环10个周期左右。

降落PCR的改进

人们为了简化实验流程，同时避免最低退火温度过低会有非特异性产物出现的可能性，将TD-PCR退火温度缩短至10个系列温度，此扩增方法称作MTD-PCR。后来人们又将MTD-PCR再次改进，将退火温度缩短至5甚至4个温度范围，并将这种方法称为SMTD-PCR。改良后的TD-PCR在每一个停留的退火温度上循环4或者5次，最后一个退火温度循环次数增加至20~30个循环，以最大可能提高其特异产物与非特异产物的比率。但改良后的TD-PCR需要从较低的退火温度开始降落，因为尽管Taq等酶耐热，但经过太长时间的高温后其活性也会下降，会由于DNA聚合酶活性丧失过多而得不到足量的PCR产物。

注意事项

• 由于降落PCR在较早的循环中需避免低Tm值配对，在降落PCR中最好应用热启动技术。
• 降落PCR虽然有一定的优势，但它并非万能，降落PCR只能做到“锦上添花”，即能看见主带，但是存在杂带，可以利用降落PCR进行优化，但是如果连主带也看不见，只有杂带，那么用了降落PCR也不会有很好的效果。

如果扩增后跑胶观察到许多产物带或高分子量成片产物，可采取以下措施：

• 提高DT-PCR的最高退火温度和最低退火温度，使其范围上移；
• 减少最低退火温度条件的循环次数；
• 使各退火温度下的循环数增加一个，如三个循环降低1℃；
• 用嵌套式引物重新扩增第一次PCR产物的稀释物（巢式PCR）；
• 放弃此套引物，重新设计引物扩增；

降落PCR与温度梯度PCR比较

降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。

温度梯度PCR是指在退火温度不太明确时，为了找到最优退火温度，在一台PCR仪上同时做多管PCR，每一管放在仪器内不同列（有的是不同行）上，分别进行PCR（如50-60℃可以分6管，分别50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃），最终找到最合适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。

降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。

与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势，因为采用梯度PCR选择合适的退火温度时需要多次反应或多管反应，并且即使通过多次试验找到最佳的退火温度后，在更换其它的PCR仪进行同样的扩增时最适的退火温度也有可能发生改变，需要重新进行最佳温度的摸索。而降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最佳复性温度的优化和测定工作，并且降落PCR在很大程度上削弱了仪器性能对扩增效果的制约。

降落PCR应用

降落PCR适用于经常更换引物的实验，在不知道Tm值，同时不想很麻烦的找出最佳Tm值的情况下，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。现在很多PCR仪具有设置降落PCR的程序，降落PCR在研究领域中已得到了广泛的应用。根据各种不同工作的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等，这些联合PCR的反应体系，所需材料均与实时定量PCR和竞争定量PCR相同，所不同的是在PCR的循环过程中使用退火温度渐低的降落PCR方法，检测PCR产物的方法与硬件也均同于实时定量PCR和竞争定量PCR。

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