永利集团3044am官方入口高保真PCR预混液（2×PCR Master Mix)为2×浓度的PCR混合液，其除了含有PCR扩增常用的dNTP和Mg2+之外，还含有一种基于基因工程改造的新一代高保真酶，其具有极高的扩增效率和高保真性，同时增加的特殊扩增促进剂也使扩增效果进一步增加。此酶具有5’→3’DNA聚合酶活性以及3’→5’外切酶活性，扩增产物为平末端，可用于后续同源重组等试验。
本品适用于以基因组DNA、cDNA、质粒等模板的PCR反应
| 组分 | 体积/μL |
|---|---|
| ddH2O | Up to 50 |
| 2× PCR Master Mix | 25 |
| 模板 | X |
| 正向引物(10 μM) | 1 |
| 反向引物(10 μM) | 1 |
注：
1.使用前请于冰上融化，震荡瞬时离心。
2.模板推荐量基因组DNA：50~150ng；质粒：5~50ng；cDNA：1~5μL（不超过反应体积的1/10）。
| 程序 | 温度/℃ | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 95 | 3 min | 1 |
| 变性 | 95 | 15 s | 35 |
| 退火a | 根据引物而定 | 15 s | |
| 延伸b | 72 | 15 s | |
| 延伸 | 72 | 5 min | 1 |
| 保存 | 4 | ∞ | 1 |
a.退火温度：一般设置为引物Tm值±3℃左右即可。
b.延伸时间：一般模板设置为15s/kb，对于一些困难模板，可延伸至20~30s/kb范围之间调整。
| 常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 无扩增产物或产物量少 | 引物 | 重新设计优化引物 |
| 退火温度 | 设置梯度，寻找合适退火温度 | |
| 引物浓度 | 适当提高引物浓度 | |
| 延伸时间 | 适当提高延伸时间 | |
| 循环数 | 适当提高循环数 | |
| 模板 | 适当增加模板量或提高模板纯度 | |
| 条带弥散或有杂带 | 引物 | 重新设计优化引物或适当降低引物浓度 |
| 退火温度 | 适当提高退火温度并寻找最适温度 | |
| 延伸时间 | 根据杂带大小而定，大于目的片段降低，小于目的片段提高延伸时间 | |
| 循环数 | 适当降低循环数 | |
| 模板 | 使用纯度高的模板或适当降低模板量 |
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