GST pull down实验流程

本文主要介绍了GST pull-down实验的服务流程（数据以实际实验为准）

GST蛋白的表达

1. 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中；
2. 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液；
3. 将种子液稀释于50ml 2x YT A(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1；
4. 28℃,220rpm摇菌培养2小时 ；
5. 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时；
6. 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5000rpmx5min离心，弃上清；
7. 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5000rpm离心5min，弃上清；
8. 超声破壁，将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12000rpm×10min，取上清；
9. 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min，离心（12000rpm,1min），取上清SDS-PAGE电泳，检测表达情况；

gst pull down 实验流程

准备50% GST琼脂糖凝胶

1. 将原75%谷胱甘肽琼脂糖凝胶的浆液弹至混匀;
2. 取677μl原液/管，3000rpm离心5min，弃上清；
3. 加500μl PBS，颠倒混匀，3000rpm离心5min，弃上清，反复5次；
4. 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶备用；

GST蛋白的纯化

1. 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min；
2. 3000rpm离心5min，弃上清；该琼脂糖凝胶上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）；
3. 在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～60min。3krpm离心5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使琼脂糖凝胶上结合6～10ml 裂解液中的GST融合蛋白；
4. 在管中加入预冷的200μl PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将琼脂糖凝胶洗涤一次， 3000rpm离心3min，弃上清；
5. 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST融合蛋白的琼脂糖凝胶；
6. 如果用于检测，在谷胱甘肽加入15～20μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。12000rpm离心1min，取上清作SDS-PAGE电泳；
7. 结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱；

检测

1. 将结合有GST融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶悬浮在500μlNETN缓冲液中加入20～30μl含有其他蛋白的溶液同时采用结合有GST空蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶平行操作作为对照；
2. 在水平摇床上，4晃动4～8小时；
3. 离心（3600rpm,2min）吸去上清，注意不要扰动底层的琼脂糖球珠；
4. 加入200μl缓冲液对琼脂糖凝胶进行洗涤。注意加入缓冲液时要贴壁加，不要直接冲击琼脂糖凝胶，随后轻柔晃
   动，使其重悬即可；
5. 低速离心（3000rpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的琼脂糖凝胶；重复步骤的洗涤2～3次；
6. 吸干琼脂糖凝胶上方的水层后，加入20～30μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于－20℃；
7. 做SDS-PAGE和Western检测另一个蛋白；

GST-pull down的对照问题

1. 做SDS-PAGE时点一个input的蛋白（即B-6＊His）阳性对照，看一下Western操作过程中试剂、操作步骤有没有问题
2. 谷胱甘肽琼脂珠上只固定GST蛋白，inputB-6＊His，用于做阴性对照，看一下是否GST会与input的蛋白相互作用

相关服务：GST pull-down服务