IPTG诱导原理（原核表达）及实验步骤

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在原核蛋白表达体系中，如E.coli（大肠杆菌表达系统），外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，本文详细讲述了常用诱导剂IPTG诱导原理，对外源蛋白诱导表达原理以及实验步骤。

原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子，也称基因表达的协同单位。E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动序列P（promoter）；而I(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。

乳糖操纵子结构基因

IPTG诱导原理

Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物（即下图中的阻遏蛋白）能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，阻止了转录的路径，从而抑制转录启动。而当有诱导剂（这里指IPTG）存在时，诱导剂可与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动子P开始发生转录，启动反应开始发生转录。

在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。而在实验中，通常选用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

IPTG诱导表达原理图

IPTG诱导表达实验方法

材料

试剂和培养基	配料
LB（Luria—Bertani）培养基	酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2% 蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0
IPTG 贮备液	2g IPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，-20℃保存
凝胶电泳加样缓冲液	50mmol/L Tris-CL(pH6.8) 50mmol/L DTT 2%SDS（电泳级） 0.1％溴酚蓝 10％甘油

原核表达鉴定详细实验步骤

表达鉴定第一天的任务，常用抗性选择根据感受态细胞选择

拿到质粒，离心（3000r/min；2min)
在质粒中加入TE【使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加入TE的量】，一般为(1μg质粒加20μLTE；2μg质粒加50μLTE；5μg质粒加100μL TE)
将质粒与TE混匀，吸取2μL混液与感受态细胞混匀
将感受态细胞放入冰箱（4℃）中，30min
取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,
再次放入冰箱（4℃）中，3min
拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
放入摇床（37℃; 195r) 中, 30nim至60min; (最佳45min)
取出离心（3000r/min；2min)
去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂平板，【先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热20min】
把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h至16h）

2. 表达鉴定第二天的任务，注意Pcold表达载体的表达温度

每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的LB(4ml)试管中，编号为“0”“1”“2”“3”
将试管放入摇床（37℃；195r) 中，【单抗3h左右；双抗4h左右；刚开始用可见分光光度计测OD值；熟练后可目测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）】，测OD值（0.6至0.8）
从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀，放入冰箱（-20℃）冻存
在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG【终浓度0.5mM最适，可根据日后表达摸索】
视不同的载体选择适合的表达环境【PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6h；37℃表达3h至4h（4支试管，“0”“1”号试管15℃表达过夜；“2”“3”试管37℃表达3h至4h）。Pcold：【全部15℃表达过夜】

3. 表达鉴定第三天，全菌的表达鉴定分析，注意控制溶质的量及溶液黏度

从每组4支的试管中均取500μL菌液加入到1.5ml离心管中，【若OD值不一样，值小的可多取】离心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀【沉淀少的，可再取菌液离心，尽量使沉淀量接近】
在每个离心管中加入500μL的DDH₂O,悬浮沉淀，离心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀
在每支离心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮沉淀【当溶质适量且均一的情况下，加入量不变；当溶质多且粘稠时，应使加入量增大，为降低粘度也可减少上液量】
放入煮样器（100℃） 25min
取出后离心（6000r/min) 3min, 电泳检测。
蛋白表达量不错，进行蛋白纯化；蛋白表达量低或者没表达，可参考原核表达FAQ相对应解决方案解决。

4. 蛋白纯化：见蛋白纯化专题