半抗原抗体制备中的免疫原设计

免疫分析技术（IA）是以抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，随后相继发展起来的酶免疫分析法（EIA）、荧光免疫分析法（FIA）和化学发光免疫分析法（CLIA）等免疫学分析方法，凭借其高灵敏性、高特异性、高通量、迅速及价格低廉的特点，在药物残留分析、环境污染物检测等领域得到了广泛应用。

大多数小分子药物、毒素、环境污染物分子质量小于1000 u，属于仅有免疫反应原性而无免疫原性的半抗原。目前制备小分子半抗原抗体的常规方法为：选择具有毒理学意义的代谢产物或原形药物作为待测物。设计合成保留待测物分子结构特征并带有活性基团的半抗原，通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫制备针对半抗原的特异性抗体。但对于分子质量较小的半抗原，尤其是分子质量小于300 u的半抗原，常常难以获得高亲和力抗体。这一问题可通过尝试新型检测模式和级联放大系统等方式进行优化，但与此同时，对检测条件和检测设备也提出了更高的要求。因此，现阶段研发方向已转移到优化半抗原设计与合成上来。

人工免疫原的设计原则

半抗原设计的目的是使半抗原刺激机体产生特异性免疫应答，并获得对待测物分子具有高亲和力的抗体。半抗原的设计中须遵循以下原则：

1.人工免疫原中的半抗原应在分子结构立体化学和电子分布上与待测物分子尽可能相似；
2.半抗原结构中的连接臂应不易于诱导产生“臂抗体”，最好使用一定长度的碳链；
3.半抗原分子应具有便于与蛋白载体偶联的活性基团（如：NH₂COOH、OH、SH等），且活性基团的存在对待测物分子的电子分布应没有影响；
4.半抗原与蛋白偶联后仍应保留待测物分子的基本结构。

因此，半抗原设计的关键在于尽可能保留原半抗原的特征结构，并在适当的位置引入合适的连接臂和与蛋白载体偶联的活性基团。

半抗原中修饰位点的选择

通常半抗原分子有多个可供选择的修饰位点，但选择不同的修饰位点后期暴露出的抗原决定簇不同，这会导致产生的抗体在效价、亲和力和特异性上都存在差异。

当修饰位点与半抗原分子的特征结构（如-COOH，-NH，-OH，环或杂环等）距离较近时，不利于半抗原分子特征结构的暴露，使得动物的免疫系统对半抗原分子特征结构的识别难度加大。因此半抗原分子中的修饰位点应远离半抗原的特征结构部分和官能团，使半抗原的特征分子结构部分得以充分暴露。另外，在半抗原分子的不同修饰位点进行化学修饰时，可能会导致半抗原分子中电子分布的改变，从而使半抗原分子的电化学性质发生改变，导致免疫原免疫活性的改变。

通常一个半抗原分子有多个不同的修饰位点时，可利用不同的修饰位点合成出几种半抗原修饰物，选择半抗原分子结构保持最完整的修饰物与载体相连制备人工免疫原；同时可以选择半抗原分子结构保持得不够完整的修饰物与载体相连制备人工免疫原。当半抗原修饰物的分子结构与原有半抗原的结构差异性越大，抗体的亲和力越弱，越有可能建立起具有高灵敏度的测定小分子化合物的间接竞争免疫分析方法。

连接臂的引入

半抗原特征分子结构与载体之间的连接部分为连接臂。引入连接臂的目的主要是为了在人工免疫原表面突显出半抗原的特征结构。连接臂的选择应该遵循以下基本原则：

1.连接臂的连接应尽量避免在目标半抗原的官能团处或靠近官能团处，最好位于重要的特征性官能团的远端。结构类似的一类化合物连接臂应当在它们具有相同结构或类似结构的位置连接以最大限度的使分子的特征部位暴露；
2.连接臂长度要适宜。连接臂太短，则载体的空间位阻影响半抗原特征结构的暴露，且半抗原结构容易受到载体局部化学环境的影响发生变化；连接臂太长，则可能因某些极性连接（氢键）或非极性连接（疏水作用）使半抗原发生“折叠”。通常认为3~6个碳原子直链是最佳的长度；
3.避免连接臂中含较强的决定簇（如芳环、共双键或杂环等），通常以含末端活性基团的链环烃为宜，以减少所产生的抗体对连接臂的过度识别。

活性基团的引入

活性基团的引入有两种方式：第一种是利用待测物上已有的活性基团通过双功能试剂引入连接臂和活性基团，使之与载体蛋白偶联。这种方案的优点是比较容易实施，但对于一些待测物，若这些活性基团是其特征结构，或偶联后改变了分子的电子分布，则会影响抗体对待测物的识别。第二种方式是直接合成待测物的带有(CH)_nCOOH、(CH)_nNH等结构的衍生物，这种方案有利于保护待测物的特征结构和分子的电子分布不受影响，但合成上有时比较困难，往往需要多步反应才能实现。

载体的选择

半抗原偶联载体不仅可增加半抗原的相对分子质量，或仅起到运载作用而且可依靠本身的结构特异性和免疫原性，诱导机体产生免疫应答反应继而诱导对半抗原分子的识别这种现象称为载体效应。常见载体一般为蛋白质，如球蛋白片段、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、兔血清白蛋白（RSA）、人血清白蛋白（HAS）、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原或兔和鸡的丙种球蛋白等。其中，最常用的载体是牛血清白蛋白(BSA)。BSA物化性质稳定、不易变性且赖氨酸含量高，分子内有很多自由的氨基，在不同的pH值和离子强度下均有较大的溶解度。钥孔血蓝蛋白（KLH）因其与脊椎动物免疫系统具有很好的异源性而被认为是优先选择的载体。

载体偶联的常用方法

半抗原修饰物与载体偶联的常用方法有化学偶联法、化学生物学方法和免疫学标记法。其中以化学偶联法最常用。一般可根据半抗原修饰物所含活基团的不同，选择不同的方式与载体蛋白进行偶联。如半抗原修饰物含羧基、则可通过碳化二亚胺法、混合酸酐法、活性酯法与载体蛋白进行偶联；半抗原修饰物含氨基，则可通过戊二醛法、二异氰酸酯法、卤代硝基苯法、亚胺酸酯法等与载体蛋白进行偶联；半抗原修饰物含羟基，则可通过琥珀酸酐法、偶氮苯甲酸法、一氯醋酸钠法等与载体蛋白进行偶联；若半抗原修饰物含疏基，可通过SAMSA反应与载体蛋白质通过二硫键交联；若半抗原修饰物含醛基或酮基，可通过O-(羧甲基)羟胺法和对肼基苯甲酸法合成带有羧基的中间体，再通过羧基与蛋白质的氨基结合。

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